製品の特長

本製品はmultiplex RT-PCR法によって、白血病に関連する28種の染色体転座および切断点を検出する試薬です。

＜HemaVision RT-Nested PCR シリーズの特長＞

• 高い特異性：Nested PCRにより目的領域を特異的に増幅
• 低い検出限界：RNA 1 µg中に存在する10^-9 µgの 転座RNAを検出可能
• 逆位の検出が可能：FISH法では困難な変異も検出（inv16）
• 結果の解釈が容易：PCR産物の電気泳動結果と対応表より転座箇所を特定
• 正確な実験：内部標準を同時に解析、実験の妥当性を検証可能
• 簡単な手法：標準的なサーマルサイクラーおよびプロトコルを使用

＜検出可能な遺伝子について＞

下記の融合遺伝子を検出できます。

＜実験ステップについて＞

① total RNA抽出

　全血、細胞株、単核球、骨髄細胞などからRNAを抽出します。

② cDNA合成

　製品に含まれているプライマーセットおよびcDNA合成試薬を使って、cDNAを合成します。

③ Master PCR-I

　複数のプライマーセットが混合されたプライマーミックスを用いてPCRを行います。

④ Master PCR-II

　Master PCR-IのPCR産物および、複数のプライマーセットが混合されたプライマーミックスを用いてPCRを行います。

⑤ 電気泳動

　Master PCR-IIのPCR産物の電気泳動を行います。転座が起きていると、ハウスキーピング遺伝子由来のDNAバンドの他にDNAバンドが観察されます。

⑥ Split-out PCR-I

　転座遺伝子が検出されたPCR産物のみを選択します。増幅したMaster PCRプライマーの番号に対応して用意されている、複数のプライマーセットが混合されたプライマーミックスを用いてPCRを行います。

⑦ Split-out PCR-II

　Split-out PCR-IのPCR産物および、複数のプライマーセットが混合されたプライマーミックスを用いてPCRを行います。

⑧ 電気泳動

　PCR産物の電気泳動を行います。転座箇所を増幅したプライマーセットのみ、ハウスキーピング遺伝子由来のDNAバンドの他にDNAバンドが観察されます。

＜電気泳動のイメージ図＞

910 bp付近のバンドは内部標準由来、それ以外は転座箇所由来となります。

・Master PCR-II後の電気泳動では、プライマーミックスM6を用いたサンプルのみ910 bp付近のバンドとは別にバンドが出ています。このため、このサンプルは転座が有ると判断し、M6の産物をSplit-out PCRに用います。

・Split-out PCR-II後の電気泳動ではM6Bのみ、910 bp付近のバンドとは別にバンドが出たため、このバンドの位置を確認します。

⑨ 転座（切断点）判別

　転座箇所由来のDNAバンドの位置（bp）をプロトコルの表と照らし合わせ、転座の同定（切断点含む）を行います。

＜本製品の構成について＞

Box1

• cDNA Primer Mix：cDNA合成用プライマーミックス（1本）
• Master PCR-I Primer Mix：Master PCR-I用プライマーミックス（8本）
• Master PCR-II Primer Mix：Master PCR-II用プライマーミックス（8本）

※プライマーミックスには、転座箇所特異的なプライマーセットおよび、ハウスキーピング遺伝子（内部標準）に特異的なコントロールプライマーセットが含まれています。

Box2

• Split-out PCR-I Primer Mix：Split-out PCR-I用プライマーミックス（37本）
• Split-out PCR-II Primer Mix：Split-out PCR-II用プライマーミックス（37本）

※プライマーミックスには、転座箇所特異的なプライマーセットおよび、ハウスキーピング遺伝子（内部標準）に特異的なコントロールプライマーセットが含まれています。Master PCRでのプライマー番号に対応し、各番号で4-6本のプライマーが含まれています。

別途、以下の試薬が必須となります。

• Reagents Module with DNA Polymerase (DND-HV06-RMP)：cDNA合成に必要な逆転写酵素、PCR酵素、バッファーやdNTPなど

　　　　　※本製品1キットあたり4キット使用します。

• RNase free water：ネガティブコントロール、試薬調製用

＜HemaVision RT-Nested PCRシリーズと検出する転座について＞

詳細は各製品ページをご確認ください。