IntestiCult OGMH内でのがん由来オルガノイドの増殖

Figure 1. IntestiCult^TM OGMH中でのがん細胞由来オルガノイドの増殖

オルガノイドは大腸がん生検からPublished Medium¹⁾を用いて樹立され、樹立後は下記プロトコルに示すように IntestiCult^TM OGMH (P0)へ交換しました。がん細胞由来オルガノイドは樹立後、継代後共にIntestiCult^TMOGMH培養において有効な増殖を示しました。データはHubrecht Organoid Technology社の許可を得て使用しました。

大腸がん由来オルガノイド培養のプロトコル

下記のプロトコルは、Wnt非依存的大腸腫瘍生検サンプルをIntestiCult^TM OGMH中で培養するために、Hubrecht Organoid Technology 社と共同開発されました。この方法では、Wnt経路に活性型変異を有していない腫瘍はオルガノイドとして維持できません。

A. 培地調製

次の例はWnt非依存的ながん細胞由来オルガノイドの培養のために100 mLのIntestiCult^TM OGMHを調整する場合のものです(IntestiCult^TM OGMH Component A + DMEM/F-12 with 15 mM HEPES)。100 mL以外の容量を調整する場合には、必要な容量に応じて調整してください。

1. IntestiCult OGMH Component Aを室温(15 - 25°C)または2 - 8°Cで一晩融解してください。試薬はよく混合し、すぐに使用するか分注して-20°Cに保存してください（-20°C保存の場合は３ヶ月まで保存可能）。分注した試薬を溶解した後はすぐに使用し、再凍結はしないでください。
2. 50 mL のIntestiCult OGMH Component Aを50 mL のDMEM/F-12 (15 mM HEPES含有)に添加します。試薬はよく混合し、すぐに使用しない場合は2 - 8°Cで1週間まで保存可能です。
3. 抗生物質（例：50 μg/mL ゲンタマイシン）を使用直前に添加します。

B. 腫瘍生検からの組織単離

1. 100 μL の Matrigel® を氷上で融解します。
   注： この容量は培養ドームを４つまで作成するのに十分な量です。
2. 次の試薬類を氷上に静置してください。：D-PBS (Ca++ 及び Mg++不含)、及びDMEM + 1% BSA （試薬の調整については製品情報シートをご参照ください）
3. 細胞培養用(Tissue culture-treated) 24ウェルプレートを37°Cのインキュベーター内で最低2時間温めます。
4. 15 mLコニカルチューブにて、組織サンプルを10 mLの氷冷PBSで洗浄します。組織は重力によって沈降させ（~5秒）、上清を吸引します。
5. ステップ４を再度行い、チューブ内の上清を1 mL残します。
6. 1 mLピペッターを用いて、組織及び残っている上清を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
7. 無菌ハサミを用いて、組織が5 mm以下の断片になるよう、よく切り刻みます。組織断片は、1 mLピペッターを用いて新しい15 mLコニカルチューブに移します。マイクロ遠心チューブをPBSでリンスし、そのリンス液を組織断片に添加します。
8. 組織断片は重力によって沈降させ（~5秒）、上清を吸引します。
9. 10 mL の Gentle Cell Dissociation Reagentを添加します。中程度のスピード（~40 rpm）のシェーカー上で振盪しながら37°C、60分間インキュベートします。
10. 290 xg で5分間遠心し、上清を吸引します。
    注 (プロトコルのリマインダーとして)：ピペットチップは予めDMEM + 1% BSAでリンスしておいてください。これにより、陰窩がピペットチップの壁に粘着するのを防止する事ができます。
11. 1 mLの氷冷DMEM + 1% BSAを添加します。1 mLピペッターを用いて、20回しっかりとピペッティングを行ってください。
    注：ピペットチップがチューブに触れないようにしてください。
12. 1 mLピペッターを用い、チューブの内容物を、内容物がある側に傾けたセルストレーナー（メッシュサイズ70 μm）に通し、15 mLコニカルチューブに回収します。内容物が入っていたチューブを1 mLのDMEM + 1% BSAでリンスし、その液もセルストレーナーを通してコニカルチューブに回収します。

C. 単離した生検組織からのオルガノイド培養

単離した組織をオルガノイドとしてプレーティングする場合には、製品情報シートのsection Bのstep 2へ進んでください。がん性の組織由来のオルガノイドをプレーティングする場合には、IntestiCult OGMH 完全培地の代わりにsection A (上述)で調整した培地を使用します。成長培地は2日ごとに交換してください。継代は6-12日ごとに行う事が可能です。継代のための完全な説明については、製品情報シートのsection Cを参照してください。がん性の組織由来のオルガノイドを継代する場合には、IntestiCult OGMH 完全培地の代わりにsection A (上述)で調整した培地を使用します。

Figure 2. IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) により、異なる患者からオルガノイドの増殖が可能

大腸腫瘍からPublished Medium¹⁾にてオルガノイドを樹立し、上記プロトコルに示す方法で継代した後にIntestiCult OGMH に変更しました。オルガノイドはIntestiCult で2回継代し、2回目の継代終了時（day 6 – 12）に撮像しました。（データはHubrecht Organoid Technology社からの提供）

使用製品リスト

参考文献

1. Sato T et al. (2011) Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141(5): 1762–72.
2. Fujii M et al. (2016) A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18(6): 827–38.
3. Dijkstra K et al. (2018) Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174(6): 1586–98.
4. Vlachogiannis G et al. (2018) Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359(6378): 920–26

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