CB由来CD34⁺細胞（新鮮または凍結）をStemSpan™ NK Cell Generation Kitで28日間培養しました。培養した細胞を回収し、フローサイトメトリーにより（A, B）CD56および（A）NKp46の発現を解析しました。死細胞は光散乱プロファイルおよび生細胞染色により除外しました。（B）28日目の生存CD56⁺NK細胞の平均頻度は77％で、CB由来CD34⁺ 細胞1個あたり約9,000のCD56⁺細胞が産生されました。95％の信頼区間（n = 45：新鮮と凍結サンプルそれぞれ23個と22個）の平均を示しています。BM由来CD34⁺細胞も同キットでNK細胞に分化させました。BMからのNK細胞の収量は一般にCBより低く、CD34⁺ 細胞1個あたり平均で約75個でした（n = 3、データ非表示）。

CB由来CD34⁺細胞からNK細胞を図1のプロトコルにしたがい作製しました。培養28日目に細胞を回収してCD56を染色し、生存するCD56⁺細胞を計測しました。K562細胞を8 μMカルセインAMとともに37℃で1時間インキュベートし2回洗浄しました。次に、CD56⁺NK細胞をエフェクター：ターゲット比5：1でカルセインAM標識K562ターゲット細胞10,000個と合わせ、U底96ウェルプレートで37℃、4時間共培養しました。EasySep™で分離した成人末梢血（PB）由来NK細胞および単球を、それぞれ陽性および陰性コントロールとして使用しました。PB NK細胞はNK Cell Differentiation SupplementとSFEM IIとともに、PB単球はSFEM IIのみでそれぞれ一晩培養しました。自然放出を検出するため、カルセインAM標識K562ターゲット細胞のみを含むコントロールウェルを設定しました。標識K562細胞を1％ Triton™ X-100で処理して最大放出を測定しました。インキュベーション後、プレートを500 x gで5分間遠心分離し、100 μLの上清を黒色プレートに移し、SpectraMax®マイクロプレートリーダー（励起485 nm /発光530 nm）で解析しました。結果は% specific lysisとして表しました。：[（試験放出 - 自然放出）x 100] /（最大放出 - 自然放出）。
CB CD34⁺由来NK細胞はPB NK細胞と比較して、K562ターゲット細胞に対して同様の殺傷活性を示します。平均値±SD（CB CD34⁺ 由来NK細胞：n = 18、PB NK細胞および単球：n = 7）を示しています。