ラーニングコーナー
2020/12/17
StemSpan™培地とサプリメントを使用した造血幹細胞・前駆細胞の増殖とNK細胞への分化
- 用途別細胞培養
一貫性ある品質 :血清・フィーダー細胞不使用により、血清やストロマ細胞株由来の変動要素を回避
優れた性能 :臍帯血由来CD34陽性細胞 1個あたり、約 9,000個のNK細胞を産生
高い利便性 :ストロマ細胞ベースの培養で行う追加の継代が不要
本稿は、STEMCELL Technologies社ウェブサイト(https://www.stemcell.com/expansion-and-differentiation-of-hematopoietic-stem-and-progenitor-cells-into-natural-killer-cells-using-stemspan-medium-and-supplements.html)の内容を簡易訳したものです。
背景
ナチュラルキラー(NK)細胞はがん細胞やウィルスに感染した細胞の殺傷能力、および炎症性サイトカインを分泌する能力を持つ、自然免疫にとって重要なリンパ球です。In vivoにおいて、ヒトのNK細胞はCD34陽性の造血幹・前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell; HSPC)に由来します。In vitroでCD34陽性細胞を増殖させ、NK細胞への分化を促す事ができれば、それはNK細胞生物学の基礎研究だけでなく、がん患者の養子免疫療法におけるNK細胞利用の研究にとっても有用なツールとなります。
StemSpan™ NK Cell Generation Kit により、ストロマ細胞を使用せず、無血清の培養条件下で臍帯血(cord blood; CB)や骨髄(bone marrow; BM)由来のCD34陽性 HSPCをNK細胞へと分化させる事ができます。
StemSpan™ NK Cell Generation Kit(ST-09960)の構成品
構成品名 * | 構成品番号(サイズ) |
---|---|
StemSpan™ SFEM II Medium | ST-09605 (100 mL) ** |
StemSpan™ Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10X) | ST-09915 (5 mL) |
StemSpan™ Lymphoid Differentiation Coating Material (100X) | ST-09925 (0.25 mL) |
StemSpan™ NK Cell Differentiation Supplement (100X) | #09950 (0.5 mL) |
* 単品でも販売しております。
** 500 mLの製品もあります(商品コード:ST-09655)
ご注意:本プロトコルで良好な結果を得るため、小分子 UM729 (ST-72332)の添加を強く推奨します。代わりにUM171も使用できますが、使用濃度の検討が必要です。詳細は製品情報シート(PIS)をご参照下さい。UM729、UM171ともStemSpan™ NK Cell Generation Kit には付属していないため、別途の購入が必要になります。
![StemSpan™培地とサプリメントを使用した造血幹細胞・前駆細胞の増殖とNK細胞への分化1.jpg](/sciencelibrary/images/e14c4fc67546844bca3f742d114f4ce3.jpg)
StemSpan™ NK Cell Generation Kit で作製したNK細胞
HSPC増殖とNK細胞分化のための培地とサプリメント
StemSpan™ NK Cell Generation Kit には、2ステップでHSPCからのNK細胞発生を促す無血清培地とコーティング剤、細胞増殖および分化用のサプリメントが含まれています(上の表を参照)。
1つ目のステップでは、CD34陽性細胞を、増殖用サプリメントを含む培地中で14日間培養し、細胞の増殖とリンパ球前駆細胞への分化を誘導します。2つ目のステップでは、分化用サプリメントと小分子UM729(ST-72332; 単品販売品)を含む培地中でそれらのリンパ球前駆細胞を追加で14日間培養し、CD56陽性NK細胞へとさらに分化させます。UM729の添加は2つ目のステップにおいて必須であり、これによりNK細胞の高い頻度と回収量に到達できます。
この培養系では、CB由来のCD34陽性細胞 1個から約 9,000個のNK細胞を作製できます(Figure 2参照)。StemSpan™ NK Cell Generation Kitは、新鮮および凍結保存されたCBまたはBM由来いずれのCD34陽性細胞にも使用できます。
Figure 1. StemSpan™ NK Cell Generation Kit によるNK細胞産生プロトコル概要
培養開始日(Day 0)に、CB由来CD34陽性細胞を播種します。培養3-4日後に培地をいっぱいまで継ぎ足し、その後3-4日毎に半量培地交換をおこないます。Day 14に、リンパ球前駆細胞となった細胞を回収し、次のNK細胞分化培養系に播き直します。図示した通り、細胞の回収と播き直しの後には培地の継ぎ足し・半量の培地交換は3-4日毎におこなう必要があります。
ご注意: UM729は NK Cell Differentiation Medium にのみ添加して使用し(プロトコルのステップ6参照)、Lymphoid Progenitor Expansion Medium には添加しないでください。詳細は下記プロトコルを参照して下さい。
プロトコル
本プロトコルは、28日間の細胞培養によってCB由来のCD34陽性細胞の増殖とCD56陽性NK細胞への分化を促すよう設計されています。プロトコルの概要はFigure 1をご参照下さい。
作業工程はCB由来のCD34陽性細胞用に最適化されています。BM由来のCD34陽性細胞を使用する場合は、作業手順を製品情報シート(PIS; Document #DX22777)でご確認ください。
ご注意: 細胞の回収量を最適化するには、細胞の健康を維持する事が重要です。細胞の健康は、培地の補充と交換についての推奨作業スケジュールの順守に大きく依存します。
- 浮遊細胞用培養プレート(non-tissue culture-treated)をStemSpan™ Lymphoid Differentiation Coating Materialでコーティングします。作業手順の詳細は製品のPISにてご確認ください。
- 凍結されたCB由来CD34陽性細胞(Human Cord Blood CD34+ Cells, Frozen)を融解します。または新鮮臍帯血からEasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II でCD34陽性細胞を分離します。
- StemSpan™ Lymphoid Progenitor Expansion Medium (StemSpan™ SFEM II + StemSpan™ Lymphoid Progenitor Expansion Supplement)を調製します。
- Lymphoid Progenitor Expansion Medium中のCD34陽性細胞の濃度が1 x 10⁴ cells/mLとなるように細胞懸濁液を希釈し、予めコーティングしたプレートに播種します。
- 37℃で14日間細胞をインキュベートします。PISの指示に従って、培地の半量交換を行います。NK細胞分化の培養系に移行するため、Day14にリンパ球前駆細胞を回収します。
- StemSpan™ NK Cell Differentiation Medium (StemSpan™ SFEM II + NK Cell Differentiation Supplement + UM729)を調製します。
- StemSpan™ NK Cell Differentiation Medium中の細胞濃度が1 x 10⁵ cells/mLとなるようにリンパ球前駆細胞懸濁液を希釈します。細胞を浮遊細胞用培養プレート(non-tissue culture-treated)に播種し、37℃でインキュベートします。PISの指示に従って、培地の半量交換を行います。
- Day28に細胞(CD56陽性のNK細胞を含む。Figure 2参照)を回収し、下流のアッセイ等に使用します。
• HSPCからNK細胞系列への分化についての研究
• 創薬研究における、治療法候補のNK細胞分化に対する効果および毒性の評価
• NK細胞を用いた細胞療法の開発に関する研究
• NK細胞関連疾患を研究するためのin vitroモデル開発
細胞の解析
上記のプロトコルにより、28日間の培養でCB由来CD34陽性細胞からNK細胞が得られます。分化したNK細胞はCD56、NKp46、NKp44、NKp30、NKG2D、CD94、CD16、KIRの細胞表面マーカーに対する標識抗体で染色でき、フローサイトメトリーで解析可能です(フローサイトメトリーの各プロットデータはFigure 2A, 3を参照)。下図に、本プロトコルを用いて得られたフローサイトメトリープロット、回収量、NK細胞頻度のデータを示します。細胞表面マーカー発現のデータに加え、細胞培養によって生じたCD56陽性細胞の頻度と回収量の平均値を示しています(Figure 2B)。
Figure 2. 細胞培養28日後のCD56陽性細胞の頻度と回収量
CB由来CD34陽性細胞(新鮮臍帯血からの分離、または凍結サンプル)をStemSpan™ NK Cell Generation Kitを用い、先述のプロトコルに従って28日間培養した結果。細胞は回収後、フローサイトメトリーで(A, B)CD56、(A)NKp46について解析しました。死細胞は散乱光プロファイルと死細胞検出染色によりデータから排除しています。(B)Day28におけるCD56陽性NK細胞(生細胞)の平均頻度は77%であり、CB由来CD34陽性細胞 1個あたり〜9000個のCD56陽性細胞が産生されました。図示したのは95%信頼区間(n=45、23個の新鮮臍帯血分離サンプルと22個の凍結CD34陽性細胞サンプル)のデータです。
BM由来CD34陽性細胞もStemSpan™ NK Cell Generation Kitを使用してNK細胞へと分化させる事ができます。BM由来HSPCから分化したNK細胞の場合、CB由来の場合より得られる細胞数は少なく、CD34陽性細胞 1個あたり平均〜75個です(n=3、データ非掲載)。
Figure 3. 28日間培養後のCD56陽性NK細胞表面マーカー発現
CB由来CD34陽性細胞をStemSpan™ NK Cell Generation Kitで28日間培養しました。分化した細胞は回収し、CD56、NKp44、NKp30、NKG2D、CD94、CD16、KIRの発現をフローサイトメトリーで解析しました。KIRの染色には、分子の異なる領域を認識する抗体クローンである180704とHP-MA4を組み合わせて使用しました。
![StemSpan™培地とサプリメントを使用した造血幹細胞・前駆細胞の増殖とNK細胞への分化4.png](/sciencelibrary/images/26407ef4411b105f0c43cb1c4b3e0d84.png)
Figure 4. 培養NK細胞が示すK562細胞株への細胞毒性
NK細胞はFigure 1のプロトコルに従い、CB由来CD34陽性細胞を28日間培養して得ました。28日目に細胞を回収し、CD56を染色してCD56陽性細胞をカウントしました。K562細胞は8 μM カルセインAMの存在下、37℃で1時間インキュベートし、2回洗浄しました。その後、CD56陽性NK細胞50,000個をカルセインAMラベルしたK562細胞10,000個(エフェクター:ターゲット比=5:1)と混合し、U底96ウェルプレートに播種し37℃で4時間、共培養しました。ポジティブコントロールとネガティブコントロールとして、EasySep™製品で分離した成人末梢血(PB)由来のNK細胞(PB NK Cells)、単球(PB Monocytes)をそれぞれ使用しました。PB NK CellsはNK Cell Differentiation Supplementを添加したSFEM II培地、PB MonocytesはSFEM II培地のみで一晩培養しました。バックグランド蛍光(Spontaneous release)を検出するため、カルセインAM標識K562細胞(ターゲット)のみのコントロールウェルを設けました。また、標識K562細胞を1% Triton™ X-100で処理し、全細胞溶解時の蛍光(Maximum release)を測定しました。インキュベーション後、プレートを500 x gで5分間遠心し、上清100 µLを黒色プレートに移しSpectraMax®(励起485 nm/検出 530 nm)で測定しました。測定結果は%Specific Lysis(特異的溶解率)として算出しました(%Specific Lysis:[試験放出(test release) – 自然放出(spontaneous release)] x 100]/ [(最大放出(maximum release) – 自然放出 ])。
CB由来CD34陽性細胞から得られたNK細胞(CB CD34+ - derived NK cells)はターゲットであるK562細胞に対し、PB NK Cellsと同等の細胞障害活性を示しました。データは平均値± SDとして記載しています (CB CD34+ - derived NK cells:n=18、PB NK CellsおよびPB Monocytes:n=7)。
解析におすすめの抗体製品
商品名 * | 商品番号 |
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Anti-Human CD34 Antibody, Clone 581 | ST-60013 |
Anti-Human CD56 Antibody, Clone HCD56 | ST-60021 |
Anti-Human CD16 Antibody, Clone 3G8 | ST-60041 |
* キットには付属していない製品です。
関連製品
商品名 * | 商品番号 |
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Human Cord Blood CD34⁺ Cells, Frozen | ST-70008 |
EasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | ST-17896 |
Human Bone Marrow CD34⁺ Cells, Frozen | ST-70002 |
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit ll | ST-17856 |
UM729 | ST-72332 |
* キットには付属していない製品です。