ラーニングコーナー
2019/11/12
Dynabeads Protein A / Gを用いた免疫沈降（IP）のコツ、よくある質問とトラブル解決法
- タンパク・遺伝子発現解析
免疫沈降（Immunoprecipitation, IP）において気をつけるポイント、よくある質問（FAQ）、そしてトラブルシューティングについてまとめました。
IPワークフローに沿って、各ステップのコツや問題解決法をご紹介します。
最終更新日 2025年11月21日
免疫沈降で使う一次抗体の選択
一次抗体には、ターゲット(標的タンパク質)への結合特異性があることが前提です。IPでの評価済みの抗体を使用するか、もしくはELISAなどで特異性を予め確認した抗体を使うことをおすすめします。
どうしても抗体価が低い抗体を用いなければならない場合には、抗原と抗体を先に反応させる間接法が適していることがあります。
プロテインAまたはプロテインG（Protein A/G）を介して抗体を担体ビーズに結合させる場合は、動物種とイムノグロブリン（Ig）のクラスによって結合の強弱が異なります(表1)。
表1 Igクラスによるプロテイン A/Gへの結合性の違い
免疫沈降に用いる担体の選択
セファロース/アガロース（Sepharose/agarose）のスラリーや、磁性ビーズ（Dynabeadsなど）がよく使われます。
セファロース/アガロースはサイズが大きく、サイズがまちまちな多孔質のマテリアルです。表面と内部の両方に抗体が結合するため、タンパク質の大量精製に向いています。
一方で、磁性ビーズであるDynabeadsはサイズが揃った小さい球状で表面のみに抗体が結合し、短時間で効率よく抗原と反応します。そのため純度と再現性が高く、比較的小スケールの免疫沈降に向いています。
特に、セファロース/アガロースによる免疫沈降において、非特異結合のバックグラウンドが高いといったトラブルがある場合は、担体を磁気ビーズに変更するだけで改善が期待できます。
Dynabeadsの洗浄、保存に関するFAQ
Dynabeads Protein A/Gでの免疫沈降の際、ビーズを洗浄せずそのまま加えてしまいました。Protein A/Gと抗体間の結合に影響はありますか？
Protein A/Gビーズの懸濁液は、0.01% Tween-20と0.09% アジ化ナトリウムを含むPBS（pH7.4）ですので、洗浄および結合用のバッファー（PBS pH7.4、0.02% Tween-20）と大きな違いはありません。たとえ懸濁液をそのまま加えても、Protein A/Gと抗体間の結合に大きな影響はないと考えられます。ただし、ビーズ懸濁液中には遊離したProtein A/G等が含まれている可能性がありますので、最初にビーズを洗浄する事によって除去して頂いた方がよりビーズと抗体の結合効率は良くなると考えられます。Dynabeadsを洗浄後、保存は可能ですか？
最初のビーズの洗浄ですがビーズの懸濁液 (phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 containing 0.1% bovine serum albumin(BSA) and 0.02% sodium azide) 中のSodium azide(アジ化ナトリウム・防腐剤)を取り除き、実験に用いるバッファーに置換することが目的です。 バッファーを置換して保存したことによる製品への影響はありませんが、洗浄することによりアジ化ナトリウムが取り除かれますので、そのまま長期保管されますとコンタミによりカビなどが発生する場合も想定されます。 数日間であれば滅菌済みのバッファーを用い、コンタミを最小限にして保存していただければ大丈夫だと思います。 この場合も再度使用する際には一度洗浄してください。Dynabeadsを一時的に凍結させてしまいましたが、使用可能ですか？
一度凍結させてしまったDynabeadsの使用は推奨していません。凍結によって皮膜に亀裂が入り磁性体が放出されることがあります。凍結/融解を繰り返すとより亀裂は大きくなると考えられるので再度の凍結保存はしないでください。緩衝液に十分に浸かった状態で冷蔵保存(2-8℃)してください（乾燥はパフォーマンスを低下させます）。凍結させてしまったDynabeadsはメーカー保証の対象外となり、ご利用はお勧めしませんが利用の可否につきましては予備実験等の結果を見てご判断いただければと思います。免疫沈降における非特異結合、バックグラウンドのトラブルを低減するコツ
免疫沈降において、抗体と標的タンパク質の結合以外の非特異結合を極力少なくすることで、純度が高くバックグラウンドが低い（S/N比が高い）理想の結果を得ることができます。
非特異結合由来のバックグラウンドを減らすにはいくつか方法があります。
まず、Inputサンプルを調製する際の可溶化バッファー（Lysis buffer）に塩や非イオン性界面活性剤を適度に加えることにより、タンパク質間やタンパク質－ビーズ間の非特異結合を減らします。また、ビーズ表面とサンプル、あるいは抗体とサンプルの接触機会を減らすことや、洗浄条件を厳しくすることによって非特異結合によるバックグラウンドを軽減できます。
具体的な対策については以下のFAQをご参照ください。
非特異結合、バックグラウンドに関するFAQ
Dynabeads Protein A/Gを用いた免疫沈降の実験で、非特異結合が起きてしまいます。改善策はありますか？
・ 洗浄が適切でない可能性があるので、洗浄の条件を厳しくしてください。・ ノニオン系界面活性剤（Tween-20、Triton X-100）を、0.01-0.1% の濃度でバッファーに加えてください。
・ ビーズを免疫沈降前にブロッキングした場合、洗浄バッファーに同一のブロッキング剤を加えてください。
・ 洗浄回数を増やしてください。
・ 洗浄時間を延長してください。
・ ビーズとサンプルのインキュベーションの時間を減らしてください。
・ 間接法で免疫沈降法を試してください。
・ 抗体の濃度を下げてください。
・ プレクリアの操作を行うとProtein A/G 又はビーズへの非特異結合を除去できることがあります。
どうすればDynabeads Protein A/GをBSAでブロッキングできますか？
Dynabeads Protein A/G はビーズ表面が親水性であるため、BSA のブロッキングは効率よく行えません。BSA によるブロッキングは疎水性表面で最も効率がよいとされているからです。 代わりに、Tween-20 を洗浄バッファーに加え（濃度0.01 - 0.1％）、より強い洗浄を行うことで非特異結合を減らす方法を推奨しております。IP Kit Dynabeads Protein A/Gを用いて共免疫沈降を行ったところ非特異結合が多いのですが、どうしたらよいでしょう？
共免疫沈降（Co-immunoprecipitation：Co-IP）を行う場合、非特異結合したタンパク質が解析を阻害することがよくあります。共免疫沈降を行う際には、専用のCo-IPキットをご利用になることを推奨いたしております。 Dynabeads Co-Immunoprecipitation kitは従来のIPキットと比較して以下の特長がございますので一度お試しください。・非常に低いバックグラウンド
・ビーズからの抗体溶出なし
・操作が早く、不安定なタンパク質複合体の分離に最適
・タンパク複合体へのタンパク分解障害の減少
・大きなタンパク複合体の分離に最適
Protein A/Gに使える担体は？ 直接法と間接法って？
免疫沈降をおこなうために一次抗体を担体に結合させる方法としては、プロテインAおよびプロテインG（Protein A/G）を介する反応が最も簡単で一般的です。
他に共有結合させる、二次抗体法、ビオチンｰアビジン結合法などがあります。
免疫沈降には直接法（Direct法）、間接法（Indirect法）と云われる2つのアプローチがあります。一般的に、予めビーズ(担体)に結合させておいた一次抗体をターゲット(抗原)と反応させる直接法が用いられますが、一次抗体と抗原を反応させてからビーズに抗原-抗体複合体を結合させる間接法が非特異結合の低減などに有効な場合もあります。
抗体の共溶出を防ぐには・クロスリンク（架橋）
免疫沈降では、一次抗体と担体を共有結合させる場合を除き、標的タンパク質を溶出する際に用いた抗体が共溶出されるトラブルが発生する可能性があります。トラブルを回避するコツとしましては、溶出を低pHなどの穏やかな条件で行うことで、共溶出を減らすことができます。
それでも共溶出が問題になるようなら、予め抗体とビーズを共有結合でクロスリンク（架橋）しておくことが可能です。ただし、クロスリンクによる抗体反応性低下のリスクがあります。
溶出とクロスリンクに関するFAQ
Dynabeads Protein A/Gを用いた免疫沈降で、低pH条件で溶出した時、解離する部位はどこでしょうか？
抗体結合タンパク質との結合pHから大きく離れたpHによる溶出に関してですが、抗体と抗原間の解離、ProteinAまたはProtein Gと抗体間の解離のいずれも考えられます。用いる抗体の性質によっても違ってきます。酸性条件下での溶出の場合、SDSバッファー、還元剤を用いた変性条件の溶出に比べると収量は減ることがあります。(DTTまたはβ-メルカプトエタノールのような還元剤は抗体内のジスルフィド架橋を壊し、軽鎖と重鎖の抗体を放出することになります。)一般的には、Dynabeads Protein Gと抗体と反応した後、クロスリンクしている状態であれば、抗体はビーズ側に残り、抗原が溶出されます。一方、クロスリンクしていない場合には抗体、抗原共に溶出されます。低pHの溶出には 100 mM Glycine-HCl, pH 2.5-3.0 100 mM Citric acid, pH 3.0 が用いられています。クロスリンクの方法については下記をご参照ください。Immunoprecipitation Crosslinking
Dynabeads Protein A/Gへの抗体のクロスリンク効率はどれくらいですか？また、クロスリンクしたビーズの再利用は可能ですか？
クロスリンクの効率に関する具体的なデータはございませんが、効率は100%ではありません。クロスリンクの効率は、お使いの抗体によっても異なってくると考えられます。 オプションの操作として、クロスリンクされなかった抗体をクロスリンク終了後に酸性バッファーで溶出する方法があります。ただし、酸の影響で、抗体によってはダメージ等を受けアフィニティーが変わってしまう恐れがありますのでご注意ください。 また、ビーズの再使用はお薦めしておりません。溶出の条件によって抗体のアフィニティーが変わってしまう恐れがあるためです。再利用される場合は、あらかじめ検証実験を行って可否を判断ください。Dynabeads Protein A/Gに抗体を架橋したのに、抗体が溶出されてしまう際の改善方法は？
- 架橋は決して100%になりません。抗体の一部は架橋されておらず、溶出で外れてしまいます。
- 架橋されていない抗体を取り除くには、架橋したすぐ後に、低いpHで直接洗浄するステップを行ってください。
- IPの前にpHを元に戻すのを忘れないでください。
免疫沈降前にビーズに架橋していない抗体を取り除いたのに、まだゲルにバンドがあって、Dynabeadsから抗体が溶出している際の対処方法は？
- もしゲルの泳動前、サンプルバッファに還元剤をお使いなら、サンプルバッファに還元剤を入れないで試してみてください。
- DTTまたはβ-メルカプトエタノールのような還元剤は抗体内のジスルフィド架橋を壊し、軽鎖と重鎖の抗体を放出することになります。
- 他の選択肢はタンパク質をpHを下げて溶出させることで、これはビーズに結合した抗体はそのまま残ります。
Dynabeadsに抗体を架橋してから免疫沈降を行ったところ、ゲルでタンパク質のバンドが見えなくなりました。どのような事が考えられますか？
抗体の結合部位が架橋で変わってしまったかもしれません。- この場合、抗体はターゲット抗原に親和性が低くなるか、全く示さなくなります。
- これは架橋を行う際のリスクとして常にございますが、共有結合による抗体カップリングという別の方法を選ぶことで容易に回避できる可能性がございます。
- 他の架橋の影響としては、意図しない（非特異）ターゲットへの親和性が高まる可能性もあります。
- このキットはDynabeadsへの共有結合による抗体カップリングが可能な優れたソリューションです（Dynabeads Protein GまたはAへの架橋と比較した場合）。
- 抗体カップリングキットはどんな抗体にも対応しています。
- カップリングキットは共有結合によるDynabeadsへの抗体カップリングのために作られています。
- 架橋と異なり、Dynabeads Antibody Couplingキットは抗体の特異性や親和性を変えません。
免疫沈降における標的タンパク質の収量に関するトラブル
免疫沈降によって、得られるはずの標的タンパク質が回収できない、あるいは収量が少ないといった場合、いくつかの原因が考えられます。
標的タンパク質の存在量が極めて少ない可能性がありますので、Inputサンプルの量が十分であるかご確認ください。また、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解を防ぐため、Inputサンプルに適切なプロテアーゼ阻害剤を加えてください。
次に、一次抗体の標的タンパク質への結合特異性、およびビーズへの結合特性についてご確認ください。
必要に応じてビーズや抗体の量、インキュベーション時間を調整します。
さらに、直接法と間接法の変更により改善する場合があります。
その他は以下のFAQもご参照ください。
Dynabeadsでの免疫沈降で、ターゲットタンパク質が回収できません。どういった原因が考えられますか？
いくつかの原因が考えられますのでまずは以下の項目を確認してみていただければと思います。・ お持ちの抗体とターゲットタンパク質の結合特異性をELISA などで確認してください
・ 抗体とビーズの結合特性を確認ください。抗体がビーズに結合しない場合、免疫沈降は行えません。
・ 間接法で免疫沈降を行っていた場合は、直接法で免疫沈降を試してください。反対に、直接法を行っていた場合は間接法を試してください。
・ ビーズ量およびサンプル量を確認してください。ビーズごとに結合容量が異なるので、それに応じて、ビーズの量や抗体の濃度を調整してください。
・ インキュベーション時間が適切でない可能性がありますので、至適条件を検討ください。
・ 別の抗体を検討ください。
免疫沈降における標的タンパク質解析
免疫沈降後の標的タンパク質を含むサンプルは通常、ゲル電気泳動（SDS-PAGEなど）で分離したあと、ウエスタンブロッティング、質量分析（マススペクトロメトリー、MS）などの方法で検出、同定します。
タンパク質間相互作用や翻訳後修飾など、多くの研究に有用な情報を提供します。
免疫沈降 よくある質問
免疫沈降（IP）
本稿の各項目をご参照ください。その他のFAQは以下リンクからご覧ください。
共免疫沈降（Co-IP）
タンパク質複合体の研究にもちいられるCo-IPについてのFAQです。
IP Kit Dynabeads Protein A/Gを用いて共免疫沈降を行ったところ非特異結合が多いのですが、どうしたらよいでしょう？
共免疫沈降（Co-immunoprecipitation：Co-IP）を行う場合、非特異結合したタンパク質が解析を阻害することがよくあります。共免疫沈降を行う際には、専用のCo-IPキットをご利用になることを推奨いたしております。 Dynabeads Co-Immunoprecipitation kitは従来のIPキットと比較して以下の特長がございますので一度お試しください。・非常に低いバックグラウンド
・ビーズからの抗体溶出なし
・操作が早く、不安定なタンパク質複合体の分離に最適
・タンパク複合体へのタンパク分解障害の減少
・大きなタンパク複合体の分離に最適
Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kitによるタンパク質複合体の精製を考えていますが、トシル基活性化ビーズにした方が収量が多いのでは？
Dynabeads Co-Immunoprecipiration Kitでエポキシ基（Dynabeads M-270 Epoxy）を採用しているのは、トシル基より非特異結合が低いためです。タンパク質複合体の精製では、回収量よりもバックグラウンドを減らすことがより重要と考えられます。トシル基の方が収量が上がる可能性はありますが、同時にバックグラウンドも上がってしまう恐れがありますのでエポキシ基活性化ビーズをお使いいただければと思います。Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kitによって組織から共免疫沈降を行う際、液体窒素で凍結した組織を使用できますか？
はい、大量の培養細胞や組織をサンプルとして用いる場合や不安定なタンパク質複合体の分離を行う場合には、細胞全体を液体窒素で超冷凍しながら破砕することをおすすめしています。これは、破砕プロセスにおいて、不安定なタンパク質複合体が壊れるのを防ぐためです。破砕したサンプルは、そのまま液体窒素で凍結させて保存可能です。界面活性剤を用いたライセートは、共免疫沈降を行う直前に半解凍状態でスタートします。 これらのステップをCryolysisと呼びます。Cryolysisの詳細なプロトコルは製品添付のマニュアルをご覧ください。Dynabeads Co-Immunoprecipitation kitに付属するBufferの組成は？
Dynabeads Co-Immunoprecipitation kitに付属しているBufferの組成は、非公開となっております。 Dynabeadsへの抗体の結合過程で使用するBufferにつきまして、Dynabeads M-270 Epoxyのマニュアル中に記載されているBufferをご参照ください。 共免疫沈降を行う際のBufferにつきまして、以下の文献中でDynabeads M-270 Epoxyを用いた共免疫沈降を行っておりますのでご参照ください。Dynabeads Co-Immunoprecipitation kit (Dynabeads M-270 Epoxy)で、グリセロールを用いた場合の抗体への影響は？
Dynabeads Co-Immunoprecipitation kit(Epoxy beads)を使用する際、グリセロールがどのように抗体の結合及び機能に影響するか特別なテストは行っておりません。 しかしながら、グリセロールの有無で、機能を失ってしまった抗体もありましたのでプロトコールには、グリセロール中で抗体を扱う場合は注意するように示してあります。 抗体がうまくワークする場合と、しない場合のいずれの可能性もございます。 カップリング前にバッファー交換をしたくない場合は、少量の予備実験で最初にグリセロールの影響を確認することをお勧めします。 うまくワークしない場合は、透析もしくはバッファー交換カラムによってバッファー交換をする必要があります。クロマチン免疫沈降（ChIP）
タンパク質－DNA結合の研究にもちいられるChIPについてのFAQです。
クロマチン免疫沈降に適したDynabeadsは？
クロマチン免疫沈降（ChIP）に最もおすすめなのは二次抗体結合Dynabeadsです。 Dynabeads Protein AやGより核酸に対する非特異結合が少ないため、クロマチン免疫沈降では二次抗体結合Dynabeadssの方がバックグラウンドの低い結果が得られるケースが多くあります。DynabeadsでChIPを行うのに必要な細胞数は？
2次抗体結合ビーズをもちいたプロトコール（下記リンク参照）では、細胞は経験上少なくとも10^6 個必要です。細胞数が多いほど安定した結果が得られる傾向にあります。参考資料
Dynabeads Protein A/Gを用いてChIPを行った例はありますか？
下記リンク（PDF）からご覧になれます。 DNAなどに対する非特異結合をを抑え、バックグラウンドが低いChIPアッセイを行いたい場合は、「2次抗体結合Dynabeads」のご利用をおすすめします。Dynabeadsを用いたChIPで、タンパクの不活化処理をフェノール・クロロホルム抽出で行ったところ上層がピンク色になりましたがその原因は？
フェノール・クロロホルム抽出時に上層がピンク色になった原因は、フェノールにより分解されたDynabeadsです。Dynabeadsはフェノールに対する耐性がないため、ビーズの構造が壊れてしまいます。 この現象を防ぐためには、フェノール・クロロホルム抽出前にDynabeadsを専用の磁石でしっかり除去することが大切です。無料サンプル申し込み
Dynabeads Protein A/Gの無料サンプルはこちらからお申し込みください。
初めてIPを行いたい方や、他の方法でIPを行っていてDynabeadsによるIPを試したい方が対象です。
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