ラーニングコーナー
2022/01/05
ヒト多能性幹細胞の維持培養でよくある質問
- 用途別細胞培養
ヒト多能性幹細胞（ヒトES/iPS細胞、hPSC）のメンテナンスについて、よくある質問とその回答をまとめました。関連する技術資料もあわせてご紹介しています。
本稿の内容は、STEMCELL Technologies社ウェブサイトの記事 Frequently Asked Questions on the Maintenance of hPSCsに基づいております。
培地の選択でよくある質問
培地を選択する際によくいただく質問にお答えします。
質問をクリックしていただくと回答が表示されます。
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私の研究用途に最適なhPSC維持培地を教えてください。
TeSR™ファミリーの各培地をおすすめします。TeSR維持培地は、最高レベルの品質と最小限のバッチ間変動を確保するために、厳密に予備スクリーニングされた高品質の原材料を使用して製造されています。これにより、実験の再現性は何度でも保証されます。また各培地は、論文で公開された組成に基づいています1-3。 フィーダーフリーのTeSR維持培地は、未分化のhPSC株を維持し、遺伝子編集、シングルセル播種、そして下流細胞型への指向性分化のために準備が整った状態で保つことができます。使用の目的に応じて最適なTeSR維持培地を選択するには、以下の資料をご利用ください。
他のフィーダーフリー培地で培養しているhPSCを、mTeSR™1（またはmTeSR™ Plus）に移行できますか？
他のTeSR™培地または他のフィーダーフリー培地で培養されたヒトESおよびiPS細胞は、mTeSR™1（またはmTeSR™ Plus）に簡単に移すことができます。細胞は、形態、多能性、および増殖速度の違いを最小限に抑えて、mTeSR™1（またはmTeSR™ Plus）にスムーズに移行する必要があります。プロトコルについては、以下の各マニュアルの7.1 Transitioning Cellsをご覧ください。
【関連動画】
mTeSR Plusへの移行（3件）
mTeSR Plusへの移行（3件）
培地の調製でよくある質問
培地を調製する際によくいただく質問にお答えします。
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TeSR™サプリメントはなぜ37℃ではなく、室温または冷蔵庫内で解凍するのですか？
TeSR™培地またはサプリメントは37℃ではなく、冷蔵庫で一晩あるいは室温で温めて解凍することを強くおすすめします。-20℃での保存から37℃のウォーターバスでの解凍までには大きな温度差があります。このように大きな温度変化によって成分が沈殿する可能性があり、さらに重要なことに成分のパフォーマンスに影響を与える可能性があります。
一旦サプリメントを解凍したらすぐに使用するか、分注して-20℃で最大3か月間保存してください。
分注済みのサプリメントを解凍した後は、すぐに使用するか、2〜8℃で最大2週間保存し、再凍結しないでください。
TeSR™培地のサプリメントが、解凍後に少し濁っているように見えます。まだ使用できますか？
サプリメントが室温になっていることを確認してください。濁りが続く場合は、ボトルを37℃のウォーターバスに約5分間入れ、サプリメントが透明になるまで時々ボトルを回してかき混ぜます。サプリメントは、基礎培地に加える前に濁りのない状態にする必要があります。
濁りが解消されない場合は、技術サポートまでお問い合わせください。
培地に抗生物質を加える必要はありますか？
いいえ。無菌操作の実施により無菌培養は十分に維持できます。Vitronectin XF™（ST-07180）には、なぜ組織培養処理されていない培養器具を使用するのですか？
Vitronectin XF™は、非組織培養処理（non TC treated）の培養器具と一緒に使用することをおすすめします。組織培養処理（TC treated）プレートに使用した場合、基質の接着に問題が生じる可能性があります。
一方、Corning® Matrigel®（Corning® #354277）またはHuman recombinant laminin 521（BLA-LN521-02）でコーティングする場合には、組織培養処理（TC treated）プレートをおすすめします。
継代・維持に関してよくある質問
細胞の継代や維持に関してよくいただく質問にお答えします。
質問をクリックしていただくと回答が表示されます。
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継代には、非酵素的解離と酵素的解離のどちらを用いるのが良いですか？
細胞の生存と接着を最適にするためには、使用するマトリックスと互換性のある適切な継代試薬を選択することが重要です。非酵素的解離試薬のReLeSR™（細胞塊での解離用）およびGentle Cell Dissociation Reagent（シングルセル・細胞塊での解離用）は、Vitronectin XF™およびMatrigel®の両方の基質と互換性があります。
しかし、酵素的解離試薬のDispaseは、Vitronectin XF™基質や、TeSR™-E8™およびTeSR™-AOF培地で維持されている細胞の継代には推奨されません。
細胞塊とシングルセルのどちらで継代すべきですか？
hPSCを細胞塊として継代すると、正常な核型を維持しながら長期的な増殖が可能になることが多くの異なる細胞株で示されています。 hPSCをシングルセルとして継代することは可能です。しかし、この方法では細胞集団に望ましくない選択的圧力がかかり、培養物に遺伝的異常が生じる可能性があることが実証されています4,5。
したがって、任意の培地でhPSCのシングルセル継代を行う場合、核型を頻繁にチェックして培養物が正常な核型を保持していることをご確認ください。
播種する細胞塊の最適な数はどのように決定しますか？
最適な細胞塊の数（つまり、分化割合が最も少ない最適なコロニーを与える播種数）を決定するには、継代時に細胞塊カウント法を実施し、一定範囲の細胞塊数を播種することをおすすめします（ウェルあたり300から始めて、300未満と300を超えるものを数ウェルずつ播種します）。使用している継代スケジュール（例：7日）に最適なコロニー形態が得られる細胞塊の数を決定します。
ROCK阻害剤はいつ必要になりますか？
ROCK（Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase）インヒビターとしても知られる、Y-27632（ST-72302）の使用は、細胞解離によって誘導されるアポトーシスを防ぐことにより、シングルセルとしてのヒト胚性幹（ES）細胞の生存を高めることが示されています6。Y-27632は、細胞を（細胞塊でなく）シングルセルとして継代する場合、細胞を凍結保存する場合、および神経前駆細胞の生成のような特定の分化プロトコルで使用できます。 hPSCを細胞塊として継代する場合、培地にY-27632を添加する必要はありません7。また、Y-27632を添加すると細胞形態の質が低下したり、培養に意図しない影響を及ぼしたりする可能性があります8。
自発的な分化が問題になるのはどのような時ですか？
継代の日に分化した領域が除去されている限り、限定的な（5〜10％）自発的分化は培養にとって問題になりません。hPSCは、in vitroで増殖すると分化する傾向があります。これはhPSCの特徴でもある、3つの異なる胚葉の細胞に分化する能力にもとづきます。TeSR™培地の多能性因子は、細胞の分化を防ぐのに役立ちますが、培養における低頻度（<10％）の自発的分化は正常で健康的です。 多くのラボでは、さまざまな手法（発現マーカー、コロニー形態、核型分析、機能的多能性評価、3胚葉分化など）を使用して、hPSCが未分化状態に維持されていることを確認しています。参考文献
- Ludwig TE et al. (2006) Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods 3(8): 637–46.
- Ludwig TE et al. (2006) Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol 24(2): 185–7.
- Chen G et al. (2011) Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods 8(5): 424–9.
- Draper JS et al. (2004) Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 22(1): 53–4.
- Buzzard JJ et al. (2004) Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol 22(4):381–2.
- Watanabe et al. (2007) A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 25(6): 681-6.
- Beers et al. (2012) Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc 7(11): 2029–40.
- Närvä et al. (2017) A Strong Contractile Actin Fence and Large Adhesions Direct Human Pluripotent Colony Morphology and Adhesion. Stem Cell Reports 9 (1): 67-76.
