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2024/01/12
神経を高次元にモデル化するヒト脳領域特異的オルガノイド
- 用途別細胞培養
ヒト多能性幹細胞 (ヒトES/iPS細胞、hPSC) から、前脳や中脳など特定の脳領域へガイド分化して脳領域特異的 (brain-region-specific) なオルガノイドを作製できます。これらの脳領域特異的オルガノイド同士を組み合わせて、または脳領域特異的オルガノイドと他の細胞型の共培養により、集合体すなわち assembloids (アセンブロイド) を作製できます。脳領域特異的オルガノイドとアセンブロイドは、脳の発生過程や神経炎症を含む疾患における生体内の複雑な細胞間相互作用をin vitroで再現する神経モデルとなります。
本稿では、ヒト前脳および中脳の脳領域特異的オルガノイドとそれらのアセンブロイドについて、作製方法やアプリケーションをご紹介します。
脳領域特異的オルガノイドと疾患モデル
脳オルガノイドはhPSC由来の3次元 (3D) 神経培養で、ヒト脳発達の主な特徴と細胞構築を再現できる研究モデルです。脳オルガノイドを用いることで、ヒト胎生初期における脳の発達をin vitroで研究できるようになりました。しかし、従来の脳オルガノイドは実験内/間で品質がばらつき、研究ツールとしての幅広い受容に課題がありました。
スタンフォード大学 Sergiu Paşca博士らの方法1, 2に基づいてSTEMCELL Technologies社が開発したSTEMdiff™分化培地を使用すれば、hPSCから均質な脳領域特異的オルガノイドを再現性高く作製できます。具体的には、背側前脳 (背側新皮質、背側外套)、腹側前脳 (腹側終脳、腹側外套下部)、中脳の各脳領域を代表するオルガノイドを作製できます (下図)。
脳領域特異的オルガノイドは、さまざまな疾患研究モデルに有用です。例えば、前脳オルガノイドを長期培養し神経毒性・変性モデルとして使用できます。また、中脳オルガノイドは2D培養した中脳ニューロンと異なり生理的なニューロメラニン様顆粒を形成するため、パーキンソン病モデルに適しています。
さまざまな脳アセンブロイドと用途
脳領域特異的オルガノイドを異なるオルガノイドや2D培養系と共培養することで、assembloids (アセンブロイド) を形成できます。このような脳アセンブロイド内では、脳の領域や細胞同士が互いにシナプスを介して接続します。そのため脳アセンブロイドは、生体内の複雑な細胞間相互作用を再現する神経疾患研究モデルとして役立ちます (下図)。3
脳アセンブロイドの作製には、主に3つの方法が用いられます。1つ目は、オルガノイドを神経系の特定部位に似せた脳領域特異的オルガノイド (背側前脳、腹側前脳および中脳オルガノイドなど) にパターニングした後、異なる脳領域特異的オルガノイド同士を融合させて作製します。例えば、中脳と線条体のオルガノイドを融合させた中脳-線条体アセンブロイドは、線条体ニューロンへのドーパミン作動性軸索投射を再現できるためパーキンソン病モデルに適しています。
2つ目は、単一の3D細胞凝集体に発生シグナルを阻害または模倣するオーガナイザー様構造 (細胞やビーズなど) を埋め込み、パターニングを時空間的に調節して作製します。
3つ目は、脳オルガノイドにシングル化した他の細胞を取り込ませて作製します。例えば、ミクログリアを取り込んだ脳アセンブロイドは、神経免疫相互作用モデルとしてアルツハイマー病研究に役立ちます。そのほか、がん細胞、血管内皮細胞を取り込んだ脳アセンブロイドはそれぞれ、腫瘍の脳転移、血液脳関門 (blood-brain barrier) の発達をモデル化できます。
脳アセンブロイドの解析は、遺伝学、解剖学、機能アッセイなどさまざまな手法で行えます (下図、解析例)。
STEMdiff™で作製する前脳・中脳オルガノイド
STEMdiff™分化培地で、発達中のヒト前脳 (背側および腹側) または中脳を代表する細胞組成と組織構造をもつ脳領域特異的オルガノイドを作製できます。各培地の組成はSergiu Paşca博士らの報告1, 2を基に、均質なオルガノイドを再現性良く作製できるよう最適化されています。
主な特長
- 血清とマトリックス不使用で、オルガノイドの埋め込みも不要です
- AggreWell™を使用してオルガノイド培養中の融合を抑え、スケールアップにも対応できます
- 細胞株間/内で再現性の高い、均質なオルガノイドを作製できます
- 播種後50日目以降も、オルガノイドを長期培養して維持できます
- 処理が容易な、均一サイズのオルガノイド
オルガノイド作製の流れ
hPSCから43日で前脳 (または中脳) オルガノイドを作製します。はじめにAggreWell™800 (800μmサイズのマイクロウェルが底面に300個刻まれた24ウェルプレート) にhPSCを播種し、均一な胚様体 (embryoid body; EB) を形成します。播種後6日目にEBを浮遊培養に移して増殖させ、続いて前脳 (または中脳) オルガノイドへの分化を導きます。播種後50日目以降も、前脳 (または中脳) オルガノイドは STEMdiff™ Neural Organoid Maintenance Kit を用いて長期維持および成熟が可能です。
プロトコールの詳細は、各製品の添付文書をご確認ください。
- 背側前脳オルガノイド: STEMdiff™ Dorsal Forebrain Organoid Differentiation Kit
- 腹側前脳オルガノイド: STEMdiff™ Ventral Forebrain Organoid Differentiation Kit
- 中脳オルガノイド: STEMdiff™ Midbrain Organoid Differentiation Kit
データ紹介
オルガノイドの均一な形態
前脳オルガノイド
中脳オルガノイド
脳領域特異的なマーカータンパク質の発現
背側前脳オルガノイドの成熟にともなう皮質層形成
中脳オルガノイドのカテコールアミン作動性ニューロンマーカー発現
脳領域特異的な電気活動の測定
MEAによる背側・腹側前脳オルガノイドの神経活動記録
STEMdiff™ Dorsal またはVentral Forebrain Organoid Differentiation Kitで作製した、hPSC播種後50日目の背側 (上段) または腹側 (下段) 前脳オルガノイドを、0.1% polyethyleneimine in borate bufferと20 μg/mL Laminin-521でコーティングした多電極アレイ (MEA; CytoView MEA 96, Axion Biosystems) に播種し、週一回、4週にわたって8電極から神経活動を記録しました (使用機器:Maestro MEA system, Axion Biosystems)。
(A) MEA上の前脳オルガノイドの代表的な明視野像。挿入図はウェルの活動電位のスパイク頻度ヒートマップ (赤 = 12 spikes/sec)。スケールバー = 1 mm。
(B) 活動電位スパイクのラスタープロットでは、背側前脳オルガノイドで1~4週目にかけて神経ネットワークバースト (ピンクの線) が増加したのに対し、腹側前脳オルガノイドでは同期間にネットワークバーストは観察されませんでした。
(C) 平均発火率 (平均±SEM;各時点3〜6個のオルガノイド) は、4週間の測定で背側前脳オルガノイドでは増加し、腹側前脳オルガノイドでは増加しませんでした。
前脳または中脳アセンブロイドの作製例
背側・腹側前脳オルガノイドのアセンブロイド
背側前脳オルガノイドとミクログリアのアセンブロイド
中脳オルガノイドとミクログリアのアセンブロイド
中脳・線条体オルガノイドのアセンブロイド
ウェビナー紹介
脳領域特異的オルガノイドとアセンブロイドについて、さらに理解を深めていただけるウェビナー動画です。視聴にはSTEMCELL Technologies社ホームページへのログインが必要です。
ヒトの発達と病気を研究するための脳オルガノイドおよびアセンブロイドの構築
Building Brain Organoids and Assembloids to Study Human Development and Disease
ガイド (脳領域特異的) 神経オルガノイド培養系による、より高次元の神経回路・機能モデリング
Guided Neural Organoid Culture Systems: Adding Dimensions to Model Neural Circuitry and Function
参考文献
- Birey F et al. (2017) Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature 545: 54–59.
- Yoon SJ et al. (2018) Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods 16: 75–8.
- Pașca SP. (2018) The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553: 437-445.