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STEMCELL Technologies HepatiCult HepatiCult Organoid Kit (Human)

  • 研究用

HepatiCult™ (Human)は、生理学的関連性の高いヒト肝臓オルガノイドを確実に樹立、増殖、および分化させることができます。ヒト肝臓オルガノイドは、細胞株や動物モデルなどの伝統的なモデル系と比較して、肝臓の発達、再生、代謝、および疾患の研究向けのより適切なモデルとなります。

本品 HepatiCult™ Organoid Kit (Human)(ST-100-0386)には、新鮮または凍結保存されたヒト肝臓組織から肝臓オルガノイドを培養するために必要な以下の各コンポーネントが含まれています。いずれも個別に購入できます。

・HepatiCult™ Organoid Initiation Medium(ST-100-0384):さまざまなドナーラインにわたって肝オルガノイドを効率的に樹立します。
・HepatiCult™ Organoid Growth Medium(ST-100-0385):肝オルガノイドを実験やバイオバンキングのために増殖および維持します。
・HepatiCult™ Organoid Differentiation Medium(ST-100-0383):肝オルガノイドを分化させ、CYP3A4活性などの肝機能を示す成熟オルガノイドを作製します。これらのオルガノイドは、2D単層、浮遊培養、ハイスループットアッセイを含むさまざまな培養プロトコルに適用可能です。

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の肝オルガノイドを、HepatiCult™ Organoid Growth Mediumで作製することもできます。STEMdiff™ Hepatocyte Kit(ST-100-0520)で分化誘導した肝前駆細胞(HP)または肝細胞様細胞(HLC)を使用します。

2018/05/14 12:00の製品情報

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本製品は研究目的にのみ使用し、人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないようにご注意ください。

製品の特長

HepatiCult™ Organoid Kit (Human) でヒト肝オルガノイドを樹立、増殖、および分化

  • ヒト肝臓オルガノイドの樹立、維持、分化のための完全な培養系
  • さまざまなドナーの肝臓組織から、効率的にオルガノイド培養を開始
  • CYP3A4活性のある成熟した肝オルガノイドを作製
  • さまざまな培養フォーマットで実験できる柔軟性

肝オルガノイドの樹立、増殖、分化の流れ

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HepatiCult™ Organoid Kit (Human)を用いて、正常ヒト肝組織由来の肝管からヒト肝オルガノイドを培養できます。
(A) HepatiCult™ Organoid Initiation Medium (OIM; Human) またはHepatiCult™ Organoid Growth Medium (OGM; Human) (下表参照)で樹立し、続いてHepatiCult™ OGMで継代して増殖します。
(B) HepatiCult™ OGMで2~3回継代した後、HepatiCult™ Organoid Differentiation Medium(ODM; Human)に切り替えることで、オルガノイドをより成熟した肝細胞型に分化させることができます。

HepatiCult™ OGMで、ヒト多能性幹細胞由来の肝オルガノイドを作製できます。詳しくはこちらのページ内 "hPSC由来 肝臓オルガノイドの作製" をご覧ください。

各培養段階に使用が推奨される培地

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HepatiCult™ Organoid Kit (Human) の推奨培地の組み合わせは、出発材料や実験目的に応じて異なる場合があります。ヒト肝組織から肝オルガノイドを樹立する場合、効率的に培養を開始するには HepatiCult™ Organoid Initiation Medium (OIM; Human) を推奨します(下図参照)。既に樹立されたオルガノイド(新鮮な培養物または凍結保存されたもの)の増殖には、HepatiCult™ Organoid Growth Medium (OGM; Human) が適しています。これらのオルガノイドは、HepatiCult™ Organoid Differentiation Medium(ODM)でさらに分化させる前に、2~3回継代して維持する必要があります。

詳しくは、製品添付文書(英語マニュアル)をご確認ください。

データ紹介

HepatiCult™ Organoid Kit (Human)で、ヒト肝組織からオルガノイドを効率よく樹立

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(A) HepatiCult™ OIMでオルガノイド培養を開始し、(B) HepatiCult™ OGMで継代しました。無血清条件では培養の(C)開始、(D)継代ともにHepatiCult™ OGMで行いました。(A,C)開始後15日目、および(B,D)継代初回の8日目で撮影した培養画像です。(E)オルガノイド形成効率を定量化すると、HepatiCult™ OIMではヒト肝組織1gあたりのオルガノイド収量が有意に高くなりました(平均±SD;n=14)。

HepatiCult™ OIMは、複数ドナーの肝組織からのオルガノイド樹立を強力にサポート

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4名のドナー由来の組織検体から樹立したオルガノイド(A-D)は、樹立15日後に形態的な異質性を示しました。これらをHepatiCult™ OGMをもちいて継代比率1:1で拡大培養すると(E-H)、初回継代終了時に健康なオルガノイドが得られました。

HepatiCult™ OGMによるオルガノイドの拡大培養

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肝オルガノイドは、複数のドナーおよび継代にわたってHepatiCult™ OGMで効率的に増殖し、無限に培養できる可能性を示しました。無血清条件で開始したオルガノイド(白抜きマーカー)は、HepatiCult™ OGMで同等の増殖速度を示しました。

増殖する肝オルガノイドが示す肝前駆細胞の特徴

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HepatiCult™ OGMで培養したヒト肝オルガノイドは、(A)KI67、(B)HNF4A、(C)SOX9の免疫細胞化学染色で観察される通り、増殖中の肝前駆細胞の特徴を示しました。増殖肝オルガノイドは、(A)EPCAM発現のような肝上皮の特徴も示しました。(B, C)核はDAPIで対比染色しています。

増殖する肝オルガノイドは、継代を複数回経ても遺伝子発現を維持

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HepatiCult™ OGMで培養した肝オルガノイドは、幹細胞マーカー(A)LGR5および(B)AXIN2、胆管マーカー(C)SOX9および(D)KRT19、ならびに肝細胞マーカー(E)HNF4aおよび(F)アルブミン(ALB)を複数の継代数にわたって発現しました。HepatiCult™ OGMでの培養中は最小限のアルブミン発現しか認められませんでした。発現レベルはqPCRで測定し、TBPおよびUBCハウスキーピング遺伝子で正規化して相対発現レベルを定量化しました(平均±SD;n = 2-5オルガノイド株)。* p < 0.05。

HepatiCult™ ODMによる肝オルガノイドの分化と形態変化

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HepatiCult™ ODMに切り替えると、オルガノイドはコンパクトで緻密な形態と、しばしば肥厚した上皮を示します。同じ培養ウェルを分化過程の各時点で画像化しました。
(A)HepatiCult™ OGMでの培養2日目、(B)HepatiCult™ OGMからHepatiCult™ ODMへの切り替え直後の培養5日目、(C)培養7日目(ODM切り替え後2日)、(D)培養10日目(同5日)、(E)培養15日目(同10日)。(F)(E)でハイライトした四角の拡大図。

肝オルガノイド分化にともなう、肝成熟と一致する遺伝子発現変化

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HepatiCult™ ODMで分化した肝オルガノイドでは、幹細胞マーカー LGR5、胆管マーカー CK19、CK7、SOX9の発現が減少し、肝細胞マーカー HNF4A、ALB、CYP3A4、ASGR1の発現が増加しました。各複製は、HepatiCult™ OGMでは継代4回目の8日目、HepatiCult™ ODMでは15日目にqPCR分析した個別のドナーサンプルに由来します。TBPおよびUBCハウスキーピング遺伝子に正規化した相対遺伝子発現レベルを示しています。

分化した肝オルガノイドが示す、成熟肝細胞の機能

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HepatiCult™ ODMで分化させた肝オルガノイドの(A)アルブミン分泌、(B)CYP3A4活性、(C)総胆汁酸産生、(D)尿素産生を測定しました。肝機能は、サプライヤー推奨の培地で培養したHepG2細胞および初代ヒト肝細胞(PHH)と比較しました。アルブミン分泌はELISAキット(Abcam)で検出し、総胆汁酸および尿素産生は比色キット(Abcam)で分析し、CYP3A4活性(誘導なしのベースライン活性)はルシフェリン-IPAキット(Promega)で測定しました(平均±SD;n=3のオルガノイド株で実験2回、n=2-3のHepG2技術的複製で実験1回、およびn=3の凍結PHHドナーサンプルで実験1回)。* p < 0.05; ** p < 0.01。

HepatiCult™ Organoid Kitは、ブタ肝オルガノイドの増殖と分化にも使用可能

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ブタ肝オルガノイドをHepatiCult™ OIMで樹立した後、(A) HepatiCult™ OGM (Human) で4回継代して増殖し、(B, C) HepatiCult™ ODM (Human) で分化しました。オルガノイドは、基底側タンパク質マーカー p120(緑)、頂端膜および胆管マーカー F-Actin(紫)、核色素 Hoechst(青)で染色されています。(D) (C)の拡大図で、F-Actin染色により胆管形成の様子がわかります。スケールバー = 50μm。データはAmy Engevik博士(Vanderbilt University Medical Center)の許可を得て使用しています。

肝オルガノイドを用いた毒性スクリーニング

HepatiCult™ Organoid Kit (Human)で作製したヒト肝オルガノイドを用いて、薬剤の毒性スクリーニングが可能

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(左) HepatiCult™ OGMで維持した増殖オルガノイドと、HepatiCult™ ODMで分化した分化オルガノイドを用いたスクリーニングの流れ。
(右) 肝オルガノイドは薬剤の毒性に対する高い感受性があります。初代肝細胞(PHH)、HepG2細胞株と比較しています。

詳しくは、学会発表ポスタープロトコル(STEMCELL Technologies社ウェブサイトに移動します)をご覧ください。

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